一些自制的紅外探測系統(tǒng)已在實驗室中開發(fā)1，以達(dá)到這種采集速度并獲得毫秒分辨率，但到目前為止，還沒有一個商業(yè)化。

  圖1 SFM-4000與IRis-F1（IRsweep）連接。

  性能參數(shù)：
  ·5ms死時間
  ·75-100 μl每次注射樣品體積
  ·臍帶容積200μl
  ·單、雙、三混
  · 100 μm至500μm光程
  ·紅外光譜4μs采集時間
  ·0.3cm-1分辨率下1000光譜/秒連續(xù)反應(yīng)監(jiān)測
  ·10-3 AU單次注射的噪聲水平
  另一個限制是分光計的信噪比，因為它與采集速度直接相關(guān)。具有更快采集速度的商用FT-IR光譜儀通常需要對多次停流曲線進(jìn)行平均，以提高信噪比，這在紅外區(qū)域內(nèi)需要處理珍貴或濃縮樣品時會出現(xiàn)問題。
  為了克服傅立葉變換紅外光譜儀的采集速度和靈敏度問題，IRsweep2公司研制了一種基于雙梳光譜的新型紅外光譜儀。IRsweep公司的IRis-F1光譜儀是一種雙梳光譜儀，專為快速動力學(xué)測量而設(shè)計。本應(yīng)用說明的目的是說明如何將Bio-Logic SFM與IRsweep IRis-F1連接起來，以毫秒時間標(biāo)度跟蹤反應(yīng)，并觀察之前沒有見過的中紅外反應(yīng)現(xiàn)象。
  1.什么是雙梳光譜？
  雙梳狀光譜儀的原理與傳統(tǒng)的傅里葉變換或色散光譜儀完全不同。兩個緊密匹配的激光源發(fā)射的寬帶紅外光束（頻率梳）通過樣品后疊加在單個探測器元件上。檢測到的光的波長是根據(jù)在探測器上觀察到的射頻信號的頻率來解析的。由于不需要運動部件，一次實驗只需4微秒就能記錄到完整的紅外光譜。因此，如本應(yīng)用說明所示，通過停流技術(shù)研究的毫秒反應(yīng)動力學(xué)可以很容易地遵循在優(yōu)越信噪比下的紅外光譜特征。基于高功率激光源，雙梳光譜儀還具有高亮度，允許在強(qiáng)吸收溶劑中進(jìn)行高光譜和時間分辨率的測量。
  2.實驗裝置
  本應(yīng)用筆記中使用了SFM-4000和IRis-F1光譜儀（見圖1）。SFM-4000有3個混合器和4個注射器，由獨立的步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動，使用戶可以完全控制體積、注射速度和混合比。SFM的FTIR附件與Iris-F1樣品室完全兼容。
  流通池使用CaF2窗口，用戶可以通過改變窗戶之間的間隔物在100μm至500μm自由改變光程。在本應(yīng)用筆記中，安裝的是100μm光程，對應(yīng)是15μl的死體積（從最后一個混合器到流通池中心）。因此，使用3ml/s的流速，對應(yīng)的死時間為5ms。最后一個混合器直接集成到FT-IR附件中，以最小化死體積。
  SFM-4000主體通過臍帶連接器連接到FT-IR流動池，臍帶將來自混合器2出口和注射器4的溶液輸送到最后一個混合器，進(jìn)入最終混合階段。通過硬截止閥與停止電機(jī)的同步來確保液流的瞬時停止。停止流量推送和IRis-F1之間的同步是使用5V TTL觸發(fā)器實現(xiàn)的。
  3.β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)改變
  β-乳球蛋白的二級結(jié)構(gòu)在用三氟乙醇作為變性劑中從β-折疊到α-螺旋的快速轉(zhuǎn)變由Gerwert等人描述4。這種快速反應(yīng)用于演示SFM-4000和IRis-F1耦合的性能。
  二級結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變是通過1:1的比例混合濃度25mg/ml的在10%三氟乙醇/20 mM DCl的重水中的β- 乳球蛋白，與60%三氟乙醇/20 mM DCl的重水中（見圖2），導(dǎo)致三氟乙醇的濃度變化從10%V到35%V。

  圖2用于β- 乳球蛋白反應(yīng)的混合序列

  用氘化水和鹽酸來避免H2O在1650cm-1處的強(qiáng)背景吸收。實驗采用每種溶液100μl和3 ml/s的總速度注入，導(dǎo)致5 ms的死時間。
  以每次4μs連續(xù)采集130毫秒得到光譜。對應(yīng)于反應(yīng)初始狀態(tài)的預(yù)觸發(fā)光譜被用作吸收光譜的背景。在后處理中，光譜在1ms內(nèi)進(jìn)行共平均，光譜以3cm-1進(jìn)行平均。

  圖3 反應(yīng)的前10ms獲得的紅外光譜。可見的連續(xù)偏移。
  圖3顯示了前10 ms測量的紅外光譜的演變，1635 cm-1和1660 cm-1處的譜帶證實了快速中間體的存在，如Gerwert等人所觀察到的。

  圖4 β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)改變：DA時間痕跡， 4次停流注射的平均
  圖4顯示了通過減去1623 cm-1處的吸光度校正基線漂移后4次停流實驗的平均值。反應(yīng)在約100ms內(nèi)完成，但在10ms以下的早期可以獲得非常明確的信號。
  1.結(jié)論
  使用標(biāo)準(zhǔn)FT-IR和臍帶連接器附件，Bio-Logic SFM可以很容易地耦合到Iris-F1雙梳光譜儀。使得小于10ms的生化反應(yīng)動力學(xué)可以在中紅外區(qū)進(jìn)行研究，而傳統(tǒng)的紅外光譜實驗是受限的。
  利用IRis-F1，在10-3 AU（吸光度單位）下以1ms的時間分辨率獲得單次停流注射的吸光度譜。共同平均多次注射或降低時間分辨率，靈敏度可以進(jìn)一步提高。
  所述實驗僅使用的SFM-4000兩個注射器，但如果用戶希望編程自動濃度研究或雙重混合實驗，則可以使用額外的兩個注射器，在這種情況下，使用一條臍帶線作為延遲線來老化第一次混合。SFM-2000和SFM-3000也可以與IRis-F1光譜儀耦合。
  參考文獻(xiàn)：
  1) J. Tang, F. Gai, A Millisecond Infrared Stopped-Flow Apparatus. Applied Spectroscopy. 2006; 60(12) ; 1477-1481.
  2) A. Hugi, G. Villares, S. Blaser, H.C. Liu, J. Faist, Mid-infrared frequency comb based on a quantum cascade laser. Nature 492, 229–233 (2012).
  3) https://irsweep.com/technology/
  4) Kauffmann, E., Gerwert, K. et al. (2001). PNAS, 98(12), 6646–6649